科研 | Postharvest Biol. Technol.：UHPLC-HRMS 代谢组学助力预测鲜切生菜褐变

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编译：微科盟萌依依，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读酶促褐变会对包装好的鲜切生菜的质量和保质期产生负面影响。生菜的代谢物谱受褐变过程的影响。本研究的目的是筛选基于代谢组学的标记化合物来预测生菜褐变，可用于辨别适合商业生产和工业育种的生菜种质。作者在两个独立的试验和生长季节中评估了具有不同褐变敏感性的长叶莴苣，并使用超高效液相色谱结合高分辨率质谱 (UHPLC-HRMS) 分析代谢物。作者运行了主成分分析 (PCA) 以可视化集群簇、趋势和判别离子特征，发现包括奎宁酸、咖啡酰奎宁酸、3-羟基十四烷二酸、菊苣甙 B、8-脱乙酰基母菊素-8-硫酸盐、二咖啡酰奎宁酸和 9S,12S,13S-三羟基-10Z-十八碳烯酸在内的七种代谢物，随着储存时间的增加而（第 0 天与第3天比）增加；而另外三种代谢物，包括山莴苣苦素-15-草酸盐、三-4-羟基苯乙酰葡糖苷和 15-脱氧乳酸-8-硫酸盐，则随着储存时间（第 0 天与第 3 天比）而减少。两种额外的酚类代谢物，二咖啡酰酒石酸和咖啡酰酒石酸，被作者鉴定为潜在的标记化合物，它存在于第 0 天鲜切的样品中，并与褐变的发展呈负相关（由 ΔHue 表示）。作者鉴定出的代谢物有助于阐明酶促褐变过程中的生化代谢和途径，并有可能作为预测褐变抗性种质的标记化合物。

论文ID

原名：Identification of marker compounds for predicting browning of fresh-cut lettuce using untargeted UHPLC-HRMS metabolomics译名：使用非靶向 UHPLC-HRMS 代谢组学鉴定用于预测鲜切生菜褐变的标记化合物
期刊：Postharvest Biology and Technology
IF：5.537发表时间：2021.06通讯作者：陈佩
通讯作者单位：美国农业部农业研究服务署贝尔茨维尔人类营养研究中心

实验设计

实验结果

1.以色相角(h◦)为代表的褐变发展过程
在这项研究中，作者通过标准化条件下成像并使用图像处理程序分析颜色参数（L*、a*、b* 和h◦）来评估生菜组织的褐变严重程度。这种方法极大地提高了评价的效率，并最大限度地减少了与传统感官评价相关的主观性。根据作者之前的研究，计算第0天和第3天样品之间色调角(ΔHue)的变化并用于指示褐变潜力，因为较小的ΔHue表明褐变反应较慢。图1 生菜中非靶向代谢组学分析的工作流程
 如图2 所示，根据第0天和第3天之间的ΔHue，将生菜种质分为三组，即高、中和低褐变组。高褐变组包含在之前的研究中会严重褐变而广为人知的种质，例如 Tall Guzmaine 及其后代 King Henry。低褐变组包括 Parris Island Cos，这是一种已知褐变严重程度始终较低的种系，以及它的后代，如Darkland 和 Green Towers。本研究中分析的种质的完整列表，以及它们的褐变潜力和分组，可以在补充信息中找到（补充表S1）。值得注意的是，季节性在本研究中发挥了重要作用，2019年7月在所有三组种质中发现的ΔHue值比2019年9月大得多就证明了这一点（图2）。然而，生菜种质的整体褐变趋势保持不变，表明遗传对这些种质的代谢和褐变具有一致的影响。图2 第0天和第3天之间低、中和高度褐变生菜种质的色相角 (ΔHue) 的平均变化。数据表示为平均值±S.E。（与低褐变组比较**p < 0.01；与中等褐变组##p < 0.01，n = 7–12）。
 2.在第0天和第3天之间进行多元PCA分析
为了比较代谢物概况并提高数据可视化和理解的便利性，作者采用PCA分数对数据集结构和组间关系的进行了初步分析。完整数据集的PCA得分图显示，这两个试验的第0天和第3天（图3A和B）样本之间存在明显的分离。PC1 分别解释了试验1和试验2的第0天和第3天之间总变异性的28% 和32%，而PC2表明每个试验中生菜种质之间的变异性。总的来说，PC1比PC2更明显。除了来自不同储存时间的样品外，不同种质的样品图没有明显分开，两个试验的PC2变异性都小于15%。这些结果表明代谢组学的变化会随着时间的推移而发生变化，并且第0天和第3天样本之间的时间效应超过了第0天或第3天生菜种质差异影响。作者制作了loading图来显示影响主成分的离子特征。在PC1和PC2上具有高负载的判别离子特征被选为褐变标记化合物的潜在候选者（图4A和B）。基于下述策略确定了具有相当大变化的离子特征（表1）。表1 初步鉴定的鲜切莴苣与褐变莴苣之间的差别代谢物
3.鉴别离子特征的识别
确定的标记化合物包括酚酸、脂肪酸、有机酸和倍半萜内酯，所有这些都存在于两项试验中。第0天和第3天样品中鉴定出的标记化合物的提取离子色谱图如图5所示。酚类化合物在色谱图的开始就被洗脱出来，而疏水性更强的化合物（如脂肪酸）在反相HPLC洗脱柱子的末尾。Abu-Reidah 等人也报告了类似的趋势。从loading图中读者可以观察到判别离子特征和褐变敏感性之间的潜在相关性（图 4）。值得注意的是，m/z 为 353.0878（C16H18O9，-0.51 ppm）的化合物 #2被记录为正象限中的一个重要标记。它被鉴定为咖啡酰奎宁酸，通过与标准品的比较证实了这一点。此外，通过与先前公布的数据进行比较，作者确认了 m/z191的MS² 产物离子。生菜中的酚类化合物主要是咖啡酸衍生物。m/z 191.0561（C7H12O6，0.91 ppm）的化合物#1 被鉴定为奎宁酸，它与咖啡酸一起是咖啡酰奎宁酸的前体。另一种酚类（化合物 #7）显示出一个去质子化的分子，m/z 为 515.1195（C25H24O12，0.56ppm），产物离子为 m/z 353、191 和 179，其 m/z 值来自全扫描 MS和 MS²，如图所示该研究与文献中的数据一致，并被鉴定为二咖啡酰奎宁酸。咖啡酰奎宁酸和二咖啡酰奎宁酸之前都被描述为与褐变相关的代谢物，在作者的研究中， #1、#2 和 #7 化合物的浓度随着褐变的发展而显著增加（表1）。这些发现与之前发表的关于咖啡酸衍生物在生菜褐变中的重要性的结果一致。此外，之前的报告表明，咖啡酰奎宁酸可用作预测鲜切生菜褐变程度的标记化合物。图3 通过 UHPLC-HRMS 从第0天和第3天样品中鉴定的代谢物的 PCA 评分图
A，试验1次；B，试验2。 作者还观察到倍半萜内酯的含量与褐变过程呈正相关（m/z 439.1957 和 341.0705）或负相关（m/z 339.0544 和 481.1139）（表1，图4-5）。基于来自 FoodComEx(https://foodcomex.org/)的MS²产物离子，#3化合物（m/z 439.1957，C₂₁H₂₈O₁₀，-0.14 ppm）被鉴定为菊苣苷 B；化合物 #6（m/z 341.0705，C15H18O7S，0.69 ppm）和 #5（m/z339.1957，C₁₅H₁₆O₇S，0.35 ppm）分别被判定为 8-脱乙酰基母菊酯-8-硫酸盐和 15-脱氧亚硫酸盐。具有MS²产物离子 m/z 257、213 和 151 的#9化合物（m/z 481.1139，C₂₅H₂₂O₁₀，0.45 ppm）根据其碎裂模式与参考的相似性被鉴定为山莴苣苦素-15-草酸盐。先前的报告表明，倍半萜内酯，如 8-脱乙酰基母菊素-8-硫酸盐和乳酸苦苷-15-草酸盐在生菜储存期间减少，并显著促进褐变发展。除了褐变外，倍半萜内酯也会导致生菜的苦味，而褐变与倍半萜内酯之间关系的机制尚不清楚。具有化学式 C₁₄H₂₆O₅ (0.91 ppm) 的#8化合物(m/z 273.1707)被确定为显著的离子特征，其含量随着褐变的发展而增加（表 1，图 4-5）。该化合物不吸收紫外线（数据未显示），表明分子结构中不存在共轭系统。此外，化合物#8的MS² 产物离子（m/z 111.0814 和 129.0921）与庚酸（一种直链脂肪酸）完全一致（图 6）。因此，基于上述信息，化合物#8 可以表征为直链羟基脂肪酸，例如 3-羟基十四烷二酸，众所周知，它与伤口有密切关系。据报道，脂肪酸可以从磷脂或溶血磷脂中释放出来，从而诱发褐变过程。检测到的大多数溶血磷脂具有 18 个碳原子的脂肪酸链，主要是亚油酸和亚麻酸，切割后显著增加，表明与创伤途径密切相关。具有化学式 C₁₈H₃₄O₅ (0.72 ppm) 的#11化合物 (m/z 329.2346) 被鉴定为 9S、12S、13S-三羟基-10Z-十八碳烯酸，它是亚油酸的代谢物，亚油酸是脂质中的主要脂肪酸之一。两种试验中该化合物的含量都随着褐变而增加（表 1）。有时脂肪酸等代谢物只是切割后的中间候选物，不同试验的代谢动力学不同。之前有报道称这种脂肪酸在切割后立即出现，然后迅速减少，这表明它不稳定。图4 从 PCA 加载图以表达第0天和第3天代谢物的判别离子特征和相关性
A，试验 1；B，试验2。判别离子特征被标记为红色。 #10化合物（m/z 581.1664，C₃₀H₃₀O₁₂，0.12 ppm）在 m/z 151、143和 175 处产生主要产物离子（表1），对应着一种可水解的单宁--三-4-羟基苯乙酰基葡糖苷的 MS²片段。该化合物的归一化离子强度在褐变过程中强烈降低。之前的报告称，在快速和慢速褐变的卷心莴苣栽培品种中切割后，三-4-羟基苯乙酰葡萄糖苷的水平会降低。本研究首次报道三-4-羟基苯乙酰葡萄糖苷也与生菜褐变发展有关。然而，这种化合物与褐变之间的机制仍然未知。图5 来自试验1(A)和试验2 (B)的生菜种质中统计代谢物的提取离子色谱图
所有的图都选择了相同的种质(PI 665,200)的代表性色谱图。峰编号对应于表 1 中列出的鉴定化合物。 4.ΔHue 与标记化合物之间的关系
众所周知，通过选择抗褐变的种质可以在实际水平上控制褐变。许多研究者已经进行了广泛的调查，以寻找与育种中生菜褐变相关的良好标记化合物。因此，作者进一步探讨了标记化合物的离子强度与褐变发展之间的关系。首先，将负载值大于10的所有判别离子特征（同一天内；第0天和第3天之间）用于相关分析,作者采用了线性相关分析来确认褐变程度（由ΔHue表示）与源自 PCA 离子判别分析的归一化离子强度（第0天）之间的联系。总体而言，表 1 中，第0天和第3天之间鉴定出的代谢物（#4化合物除外）的相关性并不显著（R2 <0.3，数据未显示）。但是，判别离子特征，例如#4化合物(m/ z 473.0792, C₂₂H₁₈O₁₂, 0.94ppm) 和#12化合物(m/z 311.0406, C₁₃H₁₂O₉,0.46 ppm) 在第0天样品显示与褐变电位呈负相关（图7）。尽管生菜是在不同季节种植和收获的，但在两个试验中都观察到了相同的趋势。这表明这两种化合物有可能用作快速选择抗褐变生菜品种的标记。#4和#12化合物分别被鉴定为二咖啡酰酒石酸和咖啡酰酒石酸，并通过参考标准进一步确认。这是首次研究表明这两种化合物可以作为褐变评价的标志物。因此，这些标记可用于快速测试抗褐变的育种品系或品种,例如，在鲜切样品中显示最高咖啡酰酒石酸 (#12) 含量的生菜品种将是褐变程度较低的品种。值得注意的是，研究中发现的所有酚类化合物并非都与褐变潜力密切相关,例如，尽管咖啡酰奎宁酸衍生物（化合物#2和#7）在第 0 天和第 3 天样品中表现出显著差异（表1），但它们的变化模式与ΔHue值无关。这一发现得到了前人报告的支持,即咖啡酰酒石酸和二咖啡酰酒石酸不能区分褐变的发展；一份报告表明，二咖啡酰酒石酸作为PPO 的底物不如咖啡酰奎宁衍生物好，或者咖啡酰酒石酸和咖啡酰奎宁衍生物位于不同的细胞或组织区室，因此与 PPO显示出不同的相互作用。图6 化合物8的 MS2产物离子与来自 m/z Cloud 库的庚酸部分匹配
该图由Mass Frontier 软件生成。A，来自当前UPLC-HRMS 数据的化合物 8 的 MS2 片段（以绿色表示）。B,化合物8与庚酸的区别（灰色代表化合物8和庚酸中均出现的离子）；C，来自文库的庚酸的 MS2 片段（以红色表示）。 5.影响褐变的多种因素
已知褐变受基因调控，然而，植物生理条件和环境因素也对褐变起着重要作用。其他因素，如农业实践、土壤、肥料、气候和收获条件，都会影响鲜切产品的最终褐变发展。众所周知，季节性在蔬菜或水果的生长中起着至关重要的作用，并显著影响其褐变的发展。因此，作者在不同季节进行了两次试验，以验证本研究中生菜种质的褐变趋势。结果表明，尽管不同品种的褐变潜力在整个试验中是一致的，这两项试验的褐变潜力不同（图2）。此外，在从第0天到第3天的褐变过程中，两项试验中鉴定出的标记化合物始终发生变化（表1）。因此，标记化合物的评估可以提供一种快速评估的方法。由于褐变过程复杂，包括遗传和环境因素，标记代谢物的应用须在收获前和/或收获后的条件下，并经过其它生菜品种验证。图7 化合物的归一化离子强度（第0天）与试验 1 (A) 和 试验2 (B)的褐变（由 ΔHue 表示）有关
根据 ΔHue 将种质分为三组（低、中和高）。线性相关分析（由 R2 表示）用来确认褐变与源自PCA 判别离子特征的离子强度之间的关系。选择具有潜在线性回归的化合物(R2>0.3)来作图。数据表示为平均值 ± S.E (n= 3~7)。

结论

总之，十二种代谢物被鉴定为长叶莴苣褐变的潜在标记化合物。其中三种（咖啡酰奎宁酸、9S、12S、13S-三羟基-10Z-十八碳烯酸和咖啡酰酒石酸）与之前的报道非常吻合，而其他九种代谢物在生菜中首次提出，它们包括奎尼酸、3-羟基十四烷二酸、菊苣甙 B、8-脱乙酰基质-8-硫酸盐、二咖啡酰奎宁酸、山莴苣苦素-15-草酸盐、三-4-羟基苯基乙酰葡糖苷和 15-脱氧乳香素-8-硫酸盐、二咖啡酰酒石酸。代谢物显示出预测基因型褐变易感性的潜力，可用于育种计划。

原文链接：  

https://doi.org/10.1016/j.postharvbio.2021.111626

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